zdorПроблемы здоровья и экологииHealth and Ecology Issues2220-09672708-6011Gomel State Medical University10.51523/2708-6011.2025-22-2-04zdor-2865Research ArticleЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА И БИОЛОГИЯEXPERIMENTAL MEDICINE AND BIOLOGYРазработка и оценка иммуноферментной тест-системы для диагностики острого вирусного гепатита ЕDevelopment and evaluation of an enzyme immunoassay for diagnosis of acute viral hepatitis Ehttps://orcid.org/0000-0003-2231-1785ЗадораИ. С.ZadoraI. S.

Задора Илона Сергеевна - старший преподаватель кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии, УО «БГМУ»; младший научный сотрудник, УП «ХОП ИБОХ НАН Беларуси».

Минск

Ilona S. Zadora - Senior Lecturer at the Department of Microbiology, Virology, Immunology, Belarusian State Medical University; Junior Researcher, Pilot Production of the Institute of Bioorganic Chemistry National Academy of Sciences of Belarus.

Minsk

zadora-ilona@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9727-1103ЖаворонокС. В.ZhavoronokS. V.

Жаворонок Сергей Владимирович - д.м.н., профессор, профессор кафедры инфекционных болезней.

Минск

Sergey V. Zhavoronok - Doctor of Medical Sciences, Professor, Professor at the Department of Infectious Diseases, Belarusian State Medical University.

Minsk

zhavoronok.s@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9887-4061АлаторцеваГ. И.AlatortsevaG. I.

Алаторцева Галина Ивановна - к.б.н., заведующая лабораторией клонирования вирусных геномов.

Москва

Galina I. Alatortseva - Candidate of Biological Sciences, Head of the Laboratory of Cloning Viral Genomes, I.I. Mechnikov Vaccine and Serum Research Institute.

Moscow

alatortseva@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-1929-0901ЩербаньА. И.ShcherbanA. I.

Щербань Александр Иванович - к.б.н., начальник научно-технического отдела.

Минск

Aleksandr I. Shcherban - Candidate of Biological Sciences, Head of the Scientific and Technical Department, Pilot Production of the Institute of Bioorganic Chemistry National Academy of Sciences of Belarus.

Minsk

a.scherban53@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2997-8892ПритвороваЛ. Н.PritvorovaL. N.

Притворова Людмила Николаевна - к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клонирования вирусных геномов.

Москва

Lyudmila N. Pritvorova - Candidate of Medical Sciences, Leading Researcher of the Laboratory of Cloning of Viral Genomes, I.I. Mechnikov Vaccine and Serum Research Institute.

Moscow

mech.inst@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3825-3906НестеренкоЛ. Н.NesterenkoL. N.

Нестеренко Любовь Николаевна - к.х.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клонирования вирусных геномов.

Москва

Lyubov N. Nesterenko - Candidate of Chemical Sciences, Leading Researcher of the Laboratory of Cloning of Viral Genomes, I.I. Mechnikov Vaccine and Serum Research Institute.

Moscow

mech.inst@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5672-9509ДавыдовВ. В.DavydovV. V.

Давыдов Владимир Витольдович - к.б.н., доцент, заведующий кафедрой биологии.

Минск

Vladimir V. Davydov - Candidate of Biological Sciences, Associate Professor, Head of the Department of Biology, Belarusian State Medical University.

Minsk

davidovvv@bsmu.byhttps://orcid.org/0000-0002-5466-2590АниськоЛ. А.AniskoL. A.

Анисько Людмила Александровна - к.м.н., доцент, доцент кафедры инфекционных болезней, УО «БГМУ»; врач высшей категории, заведующая лабораторией, УЗ «ГКИБ».

Минск

Lyudmila A. Anisko - Candidate of Medical Sciences, Associate professor, Associate professor at the Departments of Infectious Diseases, Belarusian State Medical University; Board Certified Physician, Head of the Laboratory, City Clinical Hospital of Infectious Diseases.

Minsk

luidok@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3729-5730РогачеваТ. А.RogachevaT. A.

Рогачева Тамара Альбертовна - к.м.н., доцент, доцент кафедры инфекционных болезней, УО «БГМУ»; врач лабораторной диагностики высшей квалификации, УЗ «ГКИБ».

Минск

Tamara A. Rogacheva - Candidate of Medical Sciences, Associate professor, Associate Professor at the Departments of Infectious Diseases, Belarusian State Medical University; Board Certified in Laboratory Diagnostics, City Clinical Hospital of Infectious Diseases.

Minsk

dan12.10@mail.ruhttps://orcid.org/0009-0008-1752-5440БаюрН. Г.BayurN. V.

Баюр Надежда Геннадьевна - внешний совместитель кафедры инфекционных болезней, УО «БГМУ»; биолог клинико-диагностической лаборатории, УЗ «ГКИБ».

Минск

Nadzeya G. Bayur - External Part-timer of the Department of Infectious Diseases, Belarusian State Medical University; Biologists at the Clinical Diagnostic Laboratory, City Clinical Hospital of Infectious Diseases.

Minsk

dan12.10@mail.ruЩукаН. В.ShchukaN. V.

Щука Наталья Владимировна - научный сотрудник.

Минск

Natalia V. Shchuka - Researcher, Pilot Production of the Institute of Bioorganic Chemistry National Academy of Sciences of Belarus.

Minsk

hopiboh.bel@gmail.comhttps://orcid.org/0009-0000-8611-2844МытькоЮ. А.MytkoYu. A.

Мытько Юлия Александровна - научный сотрудник.

Минск

Yulia A. Mytko - Researcher, Pilot Production of the Institute of Bioorganic Chemistry National Academy of Sciences of Belarus.

Minsk

hopiboh.bel@gmail.comСимирскийВ. В.SimirskyV. V.

Симирский Владимир Викторович - к.х.н., директор.

Минск

Vladimir V. Simirsky - Candidate of Technical Sciences, Director of the Pilot Production of the Institute of Bioorganic Chemistry National Academy of Sciences of Belarus.

Minsk

hopiboh.bel@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-6636-6801МихайловМ. И.MikhailovM. I.

Михайлов Михаил Иванович - д.м.н., профессор, член-корр. РАН, главный научный сотрудник, заведующий лабораторией вирусных гепатитов, ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»; главный научный сотрудник, ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора.

Москва

Mikhail I. Mikhailov - Doctor of Medical Sciences, Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Chief Researcher, Head of the Laboratory of Viral Hepatitis, I.I. Mechnikov Vaccine and Serum Research Institute; Chief Researcher of the Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor.

Moscow

https://orcid.org/0000-0002-0017-1892ЗверевВ. В.ZverevV. V.

Зверев Виталий Васильевич - д.б.н., профессор, академик РАН, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии, ФГАОУ ВО «ПМГМУ им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)» МЗ РФ; научный руководитель ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова».

Москва

Vitaly V. Zverev - Doctor of Biological Sciences, Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences, Head of the Department of Microbiology, Virology and Immunology, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenovskiy University); Academic Advisor, I.I. Mechnikov Vaccine and Serum Research Institute.

Moscow

Белорусский государственный медицинский университет; Хозрасчетное опытное производство Института биоорганической химии Национальной академии наук БеларусиBelarusian State Medical University; Pilot Production of the Institute of Bioorganic Chemistry National Academy of Sciences of BelarusБелорусский государственный медицинский университетBelarusian State Medical UniversityНаучно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. МечниковаI.I. Mechnikov Vaccine and Serum Research InstituteХозрасчетное опытное производство Института биоорганической химии Национальной академии наук БеларусиPilot Production of the Institute of Bioorganic Chemistry National Academy of Sciences of BelarusБелорусский государственный медицинский университет; Городская клиническая инфекционная больницаBelarusian State Medical University; City Clinical Hospital of Infectious DiseasesНаучно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова; Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии РоспотребнадзораI.I. Mechnikov Vaccine and Serum Research Institute; Central Research Institute of Epidemiology of RospotrebnadzorНаучно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова; Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет) Министерства здравоохранения Российской ФедерацииI.I. Mechnikov Vaccine and Serum Research Institute; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenovskiy University)2025290620252223545Copyright © Задора И.С., Жаворонок С.В., Алаторцева Г.И., Щербань А.И., Притворова Л.Н., Нестеренко Л.Н., Давыдов В.В., Анисько Л.А., Рогачева Т.А., Баюр Н.Г., Щука Н.В., Мытько Ю.А., Симирский В.В., Михайлов М.И., Зверев В.В., 20252025Задора И.С., Жаворонок С.В., Алаторцева Г.И., Щербань А.И., Притворова Л.Н., Нестеренко Л.Н., Давыдов В.В., Анисько Л.А., Рогачева Т.А., Баюр Н.Г., Щука Н.В., Мытько Ю.А., Симирский В.В., Михайлов М.И., Зверев В.В.Zadora I.S., Zhavoronok S.V., Alatortseva G.I., Shcherban A.I., Pritvorova L.N., Nesterenko L.N., Davydov V.V., Anisko L.A., Rogacheva T.A., Bayur N.V., Shchuka N.V., Mytko Y.A., Simirsky V.V., Mikhailov M.I., Zverev V.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.gsmu.by/jour/article/view/2865Цель исследования

Цель исследования. Разработать отечественную иммуноферментную тест-систему для определения иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита Е (ВГЕ) в сыворотке крови людей «ИФА-анти-ВГЕ IgМ» с высокой чувствительностью и специфичностью.

Материалы и методы

Материалы и методы. База для данной научной работы — УЗ «Городская клиническая инфекционная больница» г. Минска. Качественное определение антител класса М в образцах сывороток крови людей осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с применением референсных наборов — «ИФА-АНТИ-HEV-IgМ», Вектогеп Е-IgМ. Для конструирования национальной тест-системы для качественного выявления анти-ВГЕ-IgМ использовались разборные 96-луночные полистироловые планшеты; рекомбинантные антигены — аналоги белка ORF2 и ORF3 ВГЕ 3-го генотипа; конъюгированные с пероксидазой хрена антитела к IgМ человека; постпокрывающий раствор; раствор для разведения сывороток и раствор для разведения конъюгата.

Результаты

Результаты. Определены оптимальные концентрации для сорбции белков ОRF2 и ОRF3, составляющие 2 мкг/мл и 1 мкг/мл соответственно, установлено время инкубации с тетраметилбензидином (ТМБ) — 20 минут. Диагностическая чувствительность тест-системы составила не менее 99 %, диагностическая специфичность — не менее 99 %. Показатель внутрисерийной воспроизводимости составил 92,3 %, межсерийной воспроизводимости — 86,1 %. Разработаны и утверждены технические условия ТУ BY 100185093.093-2023, Инструкция по применению набора реагентов тест-система «ИФА-анти-ВГЕ-IgМ человека» для определения маркеров острого вирусного гепатита Е в сыворотке крови людей методом иммуноферментного анализа.

Заключение

Заключение. Разработана первая отечественная тест-система для определения иммуноглобулинов класса М к ВГЕ в сыворотке крови людей «ИФА-анти-ВГЕ-IgМ» методом непрямого ИФА. Проведены лабораторные и технические испытания экспериментального образца тест-системы, показавшие ее высокую диагностическую чувствительность, специфичность и воспроизводимость. Утверждена нормативно-техническая документация на тест-систему.

Objective

Objective. To develop a national high-sensitivity and marked specifity enzyme immunoassay test system for determining class М immunoglobulins to the hepatitis E virus (HEV) in human blood serum “ELISA-anti-HEV IgМ“.

Materials and methods

Materials and methods. The base for this research is City Clinical Hospital of Infectious Diseases in Minsk. Qualitative determination of anti-HEV IgМ in human blood serum samples was carried out by indirect enzyme immunoassay using reference kits – “ELISA-ANTI-HEV-IgМ“, Vecto hep E-IgМ. 96-well polystyrol strip plates were used to design a national test system for the qualitative detection of anti-HЕV-IgМ; recombinant antigens – analogues of the protein ORF2 and ORF3 HЕV of the genotype 3; antibodies against human IgM conjugated with horseradish peroxidase; post-closing solution; serum dilution solution and conjugate dilution solution.

Results

Results. Optimal concentrations for sorption of ORF2 and ORF3 proteins were determined, amounting to 2 mg/ml and 1 mg/ml. The incubation time with TMB is set to 20 minutes. Diagnostic sensitivity of the test system was no less than 99%, and diagnostic specificity was no less than 99%. The index of in-series reproducibility was 92,3%, inter-series reproducibility was 86,1%. Technical specifications TU BY 100185093.093-2023 were developed and registered. Direction for use of the reagent kit of the test system “ELISA-anti-HEV-IgM human“ for determining markers of acute viral hepatitis E in human blood serum by enzyme immunoassay was approved.

Conclusion

Conclusion. The first national test system “ELISA-anti-HЕV-IgM” for the determination of class M immunoglobulins against hepatitis E virus in human blood serum by indirect enzyme immunoassay was developed. Laboratory and technical tests of the experimental sample of the test system were carried out, shown its high diagnostic sensitivity, specificity and reproducibility. The regulatory, technical and operational documentation for the test system was approved. 

вирус гепатита ЕВГЕиммуноферментный анализиммуноглобулины класса Манти-ВГЕ-IgМhepatitis E virusHEVenzyme immunoassayimmunoglobulins class МДанная научно-исследовательская работа была выполнена в рамках финансируемого мероприятия 13 «Разработать технологию промышленного изготовления тест-систем для выявления антител IgG и IgM-классов к вирусу гепатита Е у человека и животных с использованием иммуноферментного метода анализа и организовать их производство» подпрограммы 5 «Химические продукты и молекулярные технологии» ГП «Наукоемкие технологии и техника» на 2021–2025 годы, № государственной регистрации 20213143. Авторы благодарят главного врача УЗ «Городская клиническая инфекционная больница» Н.Н. Юровского, коллектив клинико-диагностической лаборатории УЗ «Городская клиническая инфекционная больница» за помощь в организации и проведении исследований (О.Н. Долбуз, Е.А. Метлицкая, Н.В. Малиновская).This research work was carried out within the funded activity 13 “To develop a technology for the industrial production of test systems for the detection of IgG and IgM class antibodies to the hepatitis E virus in humans and animals using the enzyme immunoassay method, and organize their production” subprogram 5 “Chemical products and molecular technologies” of the State Program “High technology and techniques” for 2021-2025, State Registration No. 20213143. The authors thank the chief physician Yurovsky N.N., the staff of the clinical diagnostic laboratory of the City Clinical Hospital of Infectious Diseases for assistance in organizing and conducting the research (Dolbuz O.N., Metlitskaya E.A., Malinovskaya N.V.).ReferencesPurdy MA, Drexler JF, Meng XJ, Norder H, Okamoto H, Van der Poel WHM, et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Hepeviridae 2022. J Gen Virol. 2022 Sep;103(9). DOI: https://doi.org/10.1099/jgv.0.001778Purdy MA, Drexler JF, Meng XJ, Norder H, Okamoto H, Van der Poel WHM, et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Hepeviridae 2022. J Gen Virol. 2022 Sep;103(9). DOI: https://doi.org/10.1099/jgv.0.001778Rein DB, Stevens GA, Theaker J, Wittenborn JS, Wiersma ST. The global burden of hepatitis E virus genotypes 1 and 2 in 2005. Hepatology. 2012 Apr;55(4):988-997. DOI: https://doi.org/10.1002/hep.25505Rein DB, Stevens GA, Theaker J, Wittenborn JS, Wiersma ST. The global burden of hepatitis E virus genotypes 1 and 2 in 2005. Hepatology. 2012 Apr;55(4):988-997. DOI: https://doi.org/10.1002/hep.25505Li B, Wu H, Miao Z, Hu L, Zhou L, Lu Y. Codon Usage of Hepatitis E Viruses: A Comprehensive Analysis. Front Microbiol. 2022 Jun 21;13:938651. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.938651Li B, Wu H, Miao Z, Hu L, Zhou L, Lu Y. Codon Usage of Hepatitis E Viruses: A Comprehensive Analysis. Front Microbiol. 2022 Jun 21;13:938651. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.938651Marano G, Vaglio S, Pupella S, Facco G, Bianchi M, Calizzani G, et al. Hepatitis E: an old infection with new implications. Blood Transfus. 2015 Jan;13(1):6-17. DOI: https://doi.org/10.2450/2014.0063-14Marano G, Vaglio S, Pupella S, Facco G, Bianchi M, Calizzani G, et al. Hepatitis E: an old infection with new implications. Blood Transfus. 2015 Jan;13(1):6-17. DOI: https://doi.org/10.2450/2014.0063-14Aslan AT, Balaban HY. Hepatitis E virus: Epidemiology, diagnosis, clinical manifestations, and treatment. World J Gastroenterol. 2020 Oct 7;26(37):5543-5560. DOI: https://doi.org/10.3748/wjg.v26.i37.5543Aslan AT, Balaban HY. Hepatitis E virus: Epidemiology, diagnosis, clinical manifestations, and treatment. World J Gastroenterol. 2020 Oct 7;26(37):5543-5560. DOI: https://doi.org/10.3748/wjg.v26.i37.5543Meng XJ. Hepatitis E virus: animal reservoirs and zoonotic risk. Vet Microbiol. 2010 Jan 27;140(3-4):256-265. DOI: https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2009.03.017Meng XJ. Hepatitis E virus: animal reservoirs and zoonotic risk. Vet Microbiol. 2010 Jan 27;140(3-4):256-265. DOI: https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2009.03.017Pavio N, Meng XJ, Renou C. Zoonotic hepatitis E: animal reservoirs and emerging risks. Vet Res. 2010 Nov-Dec;41(6):46. DOI: https://doi.org/10.1051/vetres/2010018Pavio N, Meng XJ, Renou C. Zoonotic hepatitis E: animal reservoirs and emerging risks. Vet Res. 2010 Nov-Dec;41(6):46. DOI: https://doi.org/10.1051/vetres/2010018Vina-Rodriguez A, Schlosser J, Becher D, Kaden V, Groschup MH, Eiden M. Hepatitis E virus genotype 3 diversity: phylogenetic analysis and presence of subtype 3b in wild boar in Europe. Viruses. 2015 May 22;7(5):2704-2726. DOI: https://doi.org/10.3390/v7052704Vina-Rodriguez A, Schlosser J, Becher D, Kaden V, Groschup MH, Eiden M. Hepatitis E virus genotype 3 diversity: phylogenetic analysis and presence of subtype 3b in wild boar in Europe. Viruses. 2015 May 22;7(5):2704-2726. DOI: https://doi.org/10.3390/v7052704Жаворонок С.В., Карпов И.А., Михайлов М.И., Арабей А.А., Кашкур Ю.В., Кюрегян К.К. [и др.]. Интенсивность эпидемического и эпизоотического процессов инфекции, вызванной вирусом гепатита Е, на территории Республики Беларусь. Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2019;8(1):11-22. DOI: https://doi.org/10.2441l/2305-3496-2019-11001Zhavoronok SV, Karpov IA, Mikhaylov MI, Arabey AA, et al. Epidemiological and epizootic intensity of HEV in Belarus. Infectious Diseases: News, Opinions, Training. 2019;8(1):11-22. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.2441l/2305-3496-2019-11001Давыдов В.В., Жаворонок С.В., Задора И.С., Новак Л.В, Карпенко Ф.Н., Левандовская О.В. [и др.]. Распространенность антител к вирусу гепатита Е в крови белорусских доноров. Медицинский журнал. 2022;(4):53-59. DOI: https://doi.org/10.51922/1818-426X.2022.4.53Davydov VV, Zhavoronok SV, Zadora IS, Novak LV, Karpenko FN, Levandovskaya OV, et al. Prevalence of antibodies to the hepatitis E virus in the blood of belarusian donors. Medical Journal. 2022;(4):53-59. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.51922/1818-426X.2022.4.53Krumova-Valcheva GL, Di Bartolo I, Smith RP, Gyurova E, Mateva G, Milanov M, et al. Detection of HEV RNA Using One-Step Real-Time RT-PCR in Farrow-to-Finish Pig Farms in Bulgaria. Pathogens. 2023;12(5):673. DOI: https://doi.org/10.3390/pathogens12050673Krumova-Valcheva GL, Di Bartolo I, Smith RP, Gyurova E, Mateva G, Milanov M, et al. Detection of HEV RNA Using One-Step Real-Time RT-PCR in Farrow-to-Finish Pig Farms in Bulgaria. Pathogens. 2023;12(5):673. DOI: https://doi.org/10.3390/pathogens12050673Pischke S, Wedemeyer H. Hepatitis E virus infection: multiple faces of an underestimated problem. J Hepatol. 2013 May;58(5):1045-1046. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhep.2012.12.013Pischke S, Wedemeyer H. Hepatitis E virus infection: multiple faces of an underestimated problem. J Hepatol. 2013 May;58(5):1045-1046. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhep.2012.12.013Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н., Лухверчик Л.Н., Доценко В.В., Амиантова И.И. [и др.]. Разработка рекомбинантного белка капсида вируса гепатита Е третьего генотипа: клонирование, экспрессия, очистка, оценка антигенных свойств. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019;96(1):10-17. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-10-17Alatortseva GI, Sidorov AV, Nesterenko LN, Luhverchik LN, Dotsenko VV, Amiantova II, et al. Development of hepatitis E 3 genotype recombinant protein capsid of: cloning, expression, purification, evaluation of the antigenic properties. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. 2019;96(1):10-17. (in Russ.). DOI: http://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-10-17Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н., Лухверчик Л.Н., Милованова А.В., Аммур Ю.И. [и др.]. Получение рекомбинантного белка ORF3 вируса гепатита Е 3 генотипа и оценка его антигенных свойств. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018;95(5):46-53. DOI: http://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-5-46-53Alatortseva GI, Sidorov AV, Nesterenko LN, Luhverchik LN, Milovanova AV, Ammur YI, et al. Obtaining the recombinant ORF3 protein of hepatitis Е genotype 3 and evaluation of its antigenic properties. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology, 2018; 95(5):46-53. (in Russ.). DOI: http://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-5-46-53

The authors declare that there are no conflicts of interest present.