zdorПроблемы здоровья и экологииHealth and Ecology Issues2220-09672708-6011Gomel State Medical University10.51523/2708-6011.2023-20-1-19zdor-2506Research ArticleНОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИNEW TECHNOLOGIESОпыт проведения секвенирования генома Klebsiella pneumoniae с использованием метода коротких прочтений на платформе IlluminaExperience of Klebsiella pneumoniae genome sequencing using the short read method on the Illumina platformhttps://orcid.org/0000-0002-6725-5353ШафоростА. С.ShaforostA. S.

Шафорост Александр Сергеевич, старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории

Гомель

Alexander S. Shaforost, Senior Researcher at the Research Laboratory 

Gomel 

asofocl@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9542-3791ЗятьковА. А.ZiatskovA. A.

Зятьков Алексей Александрович, старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории

Гомель

Alexey A. Ziatskov, Senior Researcher at the Research Laboratory

Gomel 

ziatskovaa@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-9435-6109ВоропаевЕ. В.VoropaevE. V.

Воропаев Евгений Викторович, кандидат медицинских наук, доцент, проректор по научной работе

Гомель

Evgenii V. Voropaev, Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Vice-Rector for Scientific Work

Gomel 

voropaev.evgenii@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-1931-4224ОсипкинаО. В.OsipkinaO. V.

Осипкина Ольга Викторовна, заведующий научно-исследовательской лабораторией

Гомель

Olga V. Osipkina, Head of the Research Laboratory

Gomel 

olga.osipkina@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0213-2421ВоропаеваА. В.VoropaevaA. V.

Воропаева Алла Викторовна, кандидат биологических наук, доцент, врач клинической лабораторной диагностики

Гомель

Alla V. Voropaeva, Candidate of Biological Sciences, Associate Professor, Physician at Clinical Laboratory Diagnostics

Gomel 

allo4ka3665@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2104-585XБондаН. А.BondaN. A.

Бонда Надежда Александровна, заведующий микробиологической лабораторией

Гомель

Nadezhda A. Bonda, Head of the Microbiology Laboratory

Gomel 

bondana8448@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-0483-7329СтомаИ. О.StomaI. O.

Стома Игорь Олегович, доктор медицинских наук , доцент, ректор

Гомель

Igor O. Stoma, Doctor of Medical Sciences, Associate Professor, Rector 

Gomel 

rektor@gsmu.byГомельский государственный медицинский университетGomel State Medical UniversityРеспубликанский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человекаRepublican scientific and practical center for radiation medicine and human ecologyГомельский областной центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровьяGomel Regional Center for Hygiene, Epidemiology and Public Health202329032023201152159Copyright © Шафорост А.С., Зятьков А.А., Воропаев Е.В., Осипкина О.В., Воропаева А.В., Бонда Н.А., Стома И.О., 20232023Шафорост А.С., Зятьков А.А., Воропаев Е.В., Осипкина О.В., Воропаева А.В., Бонда Н.А., Стома И.О.Shaforost A.S., Ziatskov A.A., Voropaev E.V., Osipkina O.V., Voropaeva A.V., Bonda N.A., Stoma I.O.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.gsmu.by/jour/article/view/2506Цель исследования

Цель исследования. Рассмотреть основные этапы секвенирования генома Klebsiella pneumoniae с использованием метода коротких прочтений на платформе Illumina и описать особенности процесса пробоподготовки библиотек и анализа полученных данных.

Материалы и методы

Материалы и методы. Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) для высокопроизводительного секвенирования выделяли из культур Klebsiella pneumoniae. Пробоподготовку выполняли согласно инструкции производителя к набору Nextera XT DNA Library Prep. Секвенирование проводили на платформе Illumina MiSeq с использованием картриджа 2х151. Сборку генома до уровня контигов производили с помощью приложения SPAdes Genome Assembler на сервисе Illumina BaseSpace Sequence Hub и набора программ в среде Linux. Оценку качества сборки генома проводили с помощью сервиса QUAST.

Результаты

Результаты. Проведено секвенирование генома образцов культур K. pneumoniae с последующей оценкой качества запуска, сборкой генома и определением его основных параметров.

Заключение

Заключение. Рассмотрены основные этапы секвенирования генома K. pneumoniae с использованием метода коротких прочтений на платформе Illumina. Отмечены основные параметры оценки качества пробоподготовки, запуска и сборки генома.

Objective

Objective. To review the main stages of Klebsiella pneumoniae genome sequencing using the Illumina short-read method and describe the peculiarities of sample library preparation and analysis of the obtained data.

Materials and methods

Materials and methods. Deoxyribonucleic acid (DNA) for high-throughput sequencing was isolated from Klebsiella pneumoniae cultures. Sample preparation was performed according to the manufacturer’s instructions for the Nextera XT DNA Library Prep kit. Sequencing was performed on an Illumina MiSeq platform using a 2x151 cartridge. Genome assembly to the contigs was performed using the SPAdes Genome Assembler application on the Illumina BaseSpace Sequence Hub service and a set of programs in a Linux environment. The quality of genome assembly was assessed using the QUAST service.

Results

Results. Genome sequencing of K. pneumoniae culture samples was performed, followed by an evaluation of the quality of the launch, assembly of the genome, and determination of its main parameters.

Conclusion

Conclusion. The main steps of K. pneumoniae genome sequencing have been considered using the short-read method on the Illumina platform. The main parameters for assessing the quality of sample preparation, launch and genome assembly are described.

высокопроизводительное секвенированиеIlluminaсборка геномапрокариотыhigh throughput sequencingIlluminagenome assemblyprokaryotesReferencesGupta N, Verma VK. Next-Generation Sequencing and Its Application: Empowering in Public Health Beyond Reality. In: Arora PK, editor. Microbial Technology for the Welfare of Society, Singapore: Springer; 2019. p. 313-341. DOI: https://doi.org/10.1007/978-981-13-8844-6_15Gupta N, Verma VK. Next-Generation Sequencing and Its Application: Empowering in Public Health Beyond Reality. In: Arora PK, editor. Microbial Technology for the Welfare of Society, Singapore: Springer; 2019. p. 313-341. DOI: https://doi.org/10.1007/978-981-13-8844-6_15Pervez MT, Hasnain MJU, Abbas SH, Moustafa MF, Aslam N, Shah SSM. A Comprehensive Review of Performance of Next-Generation Sequencing Platforms. Biomed Res Int. 2022 Sep 2022;29:345780. DOI: https://doi.org/10.1155/2022/3457806Pervez MT, Hasnain MJU, Abbas SH, Moustafa MF, Aslam N, Shah SSM. A Comprehensive Review of Performance of Next-Generation Sequencing Platforms. Biomed Res Int. 2022 Sep 2022;29:345780. DOI: https://doi.org/10.1155/2022/3457806AmpliSeq for Illumina Community Panels. [дата обращения 2023 январь 24]. Режим доступа: https://emea.illumina.com/products/by-brand/ampliseq/community-panels.htmlAmpliSeq for Illumina Community Panels. [дата обращения 2023 январь 24]. Режим доступа: https://emea.illumina.com/products/by-brand/ampliseq/community-panels.htmlGoodwin, S., McPherson, J. & McCombie, W. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 2016;17:333-335. DOI: https://doi.org/10.1038/nrg.2016.49Goodwin, S., McPherson, J. & McCombie, W. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 2016;17:333-335. DOI: https://doi.org/10.1038/nrg.2016.49Quality Scores for Next-Generation Sequencing. [дата обращения 2023 январь 24]. Режим доступа: https://www.illu-mina.com/documents/products/technotes/technote_Q-Scores.pdfQuality Scores for Next-Generation Sequencing. [дата обращения 2023 январь 24]. Режим доступа: https://www.illu-mina.com/documents/products/technotes/technote_Q-Scores.pdfCluster density guidelines for Illumina sequencing platforms using non-patterned flow cells. [дата обращения 2023 январь 23]. Режим доступа: https://emea.support.illumina.com/bulletins/2016/10/cluster-density-guidelines-for-illumina-sequencing-platforms-.htmlCluster density guidelines for Illumina sequencing platforms using non-patterned flow cells. [дата обращения 2023 январь 23]. Режим доступа: https://emea.support.illumina.com/bulletins/2016/10/cluster-density-guidelines-for-illumina-sequencing-platforms-htmlMiSeq System Denature and Dilute Libraries Guide (15039740). [дата обращения 2022 декабрь 15]. Режим доступа: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/miseq-denature-dilute-libraries-guide-15039740-10.pdfMiSeq System Denature and Dilute Libraries Guide (15039740). [дата обращения 2022 декабрь 15]. Режим доступа: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/miseq-denature-dilute-libraries-guide-15039740-10.pdfHow much PhiX spike-in is recommended when sequencing low diversity libraries on Illumina platforms? [дата обращения 2022 сентябрь 21]. Режим доступа: https://emea.support.illumina.com/bulletins/2017/02/how-much-phix-spike-in-is-recommended-when-sequencing-low-divers.htmlHow much PhiX spike-in is recommended when sequencing low diversity libraries on Illumina platforms? [дата обращения 2022 сентябрь 21]. Режим доступа: https://emea.support.illumina.com/bulletins/2017/02/how-much-phix-spike-in-is-recommended-when-sequencing-low-divers.htmlBabraham Bioinformatics FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. [дата обращения 2022 октябрь 5]. Режим доступа: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Babraham Bioinformatics FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. [дата обращения 2022 октябрь 5]. Режим доступа: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/SPAdes-Genome-Assembler Details BaseSpace Sequence Hub. [дата обращения 2023 январь 16]. Режим доступа: https://basespace.illumina.com/apps/3047044/SPAdes-Genome-Assembler?preferredversionSPAdes-Genome-Assembler Details BaseSpace Sequence Hub. [дата обращения 2023 январь 16]. Режим доступа: https://basespace.illumina.com/apps/3047044/SPAdes-Genome-Assembler?preferredversionBioinformatics portal Galaxy | Europe. [дата обращения 2023 январь 24]. Режим доступа: https://usegalaxy.eu/root?tool_id=toolshed.g2.bx.psu.edu%2Frepos%2Fnml%2Fspades%2Fspades%2F3.15.4%2Bgalaxy1Bioinformatics portal Galaxy | Europe. [дата обращения 2023 январь 24]. Режим доступа: https://usegalaxy.eu/root?tool_id=toolshed.g2.bx.psu.edu%2Frepos%2Fnml%2Fspades%2Fspades%2F3.15.4%2Bgalaxy1Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014;30:2114-2120. DOI: https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014;30:2114-2120. DOI: https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170Bankevich A, Nurk S, Antipov D, Gurevich AA, Dvorkin M, Kulikov AS, et al. SPAdes: A New Genome Assembly Algorithm and Its Applications to Single-Cell Sequencing. Journal of Computational Biology. 2012;19:455-477. DOI: https://doi.org/10.1089/cmb.2012.0021Bankevich A, Nurk S, Antipov D, Gurevich AA, Dvorkin M, Kulikov AS, et al. SPAdes: A New Genome Assembly Algorithm and Its Applications to Single-Cell Sequencing. Journal of Computational Biology. 2012;19:455-477. DOI: https://doi.org/10.1089/cmb.2012.0021Releases ablab/spades. GitHub [дата обращения 2023 январь 16]. Режим доступа: https://github.com/ablab/spades/releasesReleases ablab/spades. GitHub [дата обращения 2023 январь 16]. Режим доступа: https://github.com/ablab/spades/releasesСиколенко МА, Сергеев РС, Валентович ЛН. Метод оценки полноты нуклеотидных данных для сборки геномных последовательностей на основе расчёта доли смежных контигов. B: Материалы II междунар. науч.-практ. конф. «Компьютерные технологии и анализ данных (CTDA’2020)» (Минск, 23–24 апреля 2020 г). Минск: БГУ; 2019. с. 162-166. [дата обращения 2023 январь 18]. Режим доступа: https://elib.bsu.by/handle/123456789/248660Sikolenko MA, Sergeev RS, Valentovich LN. A method for assessing the completeness of nucleotide data for genomic sequences based on the calculation of the proportions of contiguous contig assemblies. In: Proceedings of the II Intern. scientific-practical. conf. «Computer technologies and data analysis (CTDA’2020)» (Minsk, April 23-24, 2020) Minsk: BSU; 2019. p. 162-166. [Date of access 2023 january 18]. Mode of access: https://elib.bsu.by/handle/123456789/248660 (in Russ.).QUAST Quality Assessment Tool for Genome Assemblies [дата обращения 2023 январь 23]. Режим доступа: https://cab.cc.spbu.ru/quast/QUAST Quality Assessment Tool for Genome Assemblies [Date of access 2023 january 23]. Mode of access: https://cab.cc.spbu.ru/quast/Bortolaia V, Kaas RS, Ruppe E, Roberts MC, Schwarz S, Cattoir V, et al. ResFinder 4.0 for predictions of phenotypes from genotypes. J Antimicrob Chemother. 2020;75:3491-3500. DOI: https://doi.org/10.1093/jac/dkaa345Bortolaia V, Kaas RS, Ruppe E, Roberts MC, Schwarz S, Cattoir V, et al. ResFinder 4.0 for predictions of phenotypes from genotypes. J Antimicrob Chemother 2020;75:3491–5000 [Date of access 2023 january 09]. Mode of access: https://doi.org/10.1093/jac/dkaa345ResFinder 4.1 Identifcation of acquired antibiotic resistance genes [дата обращения 2023 январь 10]. Режим доступа: https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/ResFinder 4.1 Identifcation of acquired antibiotic resistance genes [Date of access 2023 january 10]. Mode of access: https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/McArthur AG, Waglechner N, Nizam F, Yan A, Azad MA, Baylay AJ, et al. The comprehensive antibiotic resistance database. Antimicrob Agents Chemother 2013;57:3348-3357. DOI: https://doi.org/10.1128/AAC.00419-13McArthur AG, Waglechner N, Nizam F, Yan A, Azad MA, Baylay AJ, et al. The comprehensive antibiotic resistance database. Antimicrob Agents Chemother 2013;57:3348-3357. DOI: https://doi.org/10.1128/AAC.00419-13The Comprehensive Antibiotic Resistance Database. [дата обращения 2023 январь 09]. Режим доступа: https://card.mcmaster.ca/analyze/rgiThe Comprehensive Antibiotic Resistance Database . [Date of access 2023 january 09]. Mode of access: https://card.mcmaster.ca/analyze/rgiMLST 2.0 Multi Locus Sequence Typing [дата обращения 2023 январь 09]. Режим доступа: https://cge.food.dtu.dk/services/MLST/MLST 2.0 Multi Locus Sequence Typing [Date of access 2023 january 09]. Mode of access: https://cge.food.dtu.dk/services/MLST/

The authors declare that there are no conflicts of interest present.